牦牛酸奶中植物乳杆菌SHY21-2产生的广谱新型细菌素：纯化，抗菌特性和抗菌机理
——西南大学索化夷教授课题组
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近日西南大学食品科学学院索化夷教授团队在国际期刊《LWT-FoodScienceandTechnology》在线发表题为“Abroad-spectrumnovelbacteriocinproducedbyLactobacillusplantarumSHY21–2fromyakyogurt:Purification,antimicrobialcharacteristicsandantibacterialmechanism”的研究论文。彭书东、宋佳佳副教授为论文共同第一作者，索化夷教授和信金伟副研究员为论文的共同通讯作者，西南大学食品科学学院为第一完成单位。
●研究背景
在食品的运输和储存过程中，有害微生物会滋生，从而导致食品腐败，甚至对人体造成损害。目前，化学防腐剂常用于防止食品腐败。但是化学防腐剂对人体有一定的毒性作用。例如，苯甲酸钠和苯甲酸钾在体外对人淋巴细胞的突变和细胞毒性。因此，寻找更合理的化学防腐剂替代品成为研究人员的目标。乳酸菌(LAB)产生的细菌素可以抑制食源性病原体和食品腐败菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌。细菌素因其安全性吸引了许多研究人员的兴趣，因为它是由核糖体合成的蛋白质或肽，产生它的细菌被认为是安全的微生物。到目前为止，只有乳酸链球菌素被美国食品和药物管理局批准用于食品。然而，乳酸链球菌素有几个缺点，限制了它在食品工业中的应用。例如，它在中性至碱性的酸碱度下不稳定，在较宽的酸碱度范围内溶解度降低，并且只对革兰氏阳性菌有活性。因此，寻找新的高效广谱细菌素成为研究热点。有研究表明，牦牛酸奶中含有非常丰富的乳酸菌资源。因此，从牦牛酸奶中分离乳酸菌并筛选产细菌素乳酸菌具有明显的优势。
1.菌株21-2的鉴定
图1根据16SrDNA序列构建菌株21-2的进化树
菌株21-2是革兰氏阳性细菌。根据APILABplus系统的鉴定结果，菌株21-2为植物乳杆菌，ID值为99.9%，T值为0.63。此外，测序得到bp的16SrRNA基因序列，与植物乳杆菌IMAU相似度为%。
2.全基因组测序
图2基因组编码蛋白质COG功能的分类和统计
本研究预测了植物乳杆菌SHY21-2A共个编码基因。根据蛋白质的直向同源群簇，鉴定的编码蛋白质被分为26个功能类别，尽管只发现了22个。
3.生长曲线和细菌素生产
图3LP21-2的生长曲线及细菌素产量
LP21-2在6小时时进入对数生长期，在22至48小时处于稳定期。pH值从2小时开始下降，24小时后稳定。菌株在14小时开始显示抗菌活性，在26小时达到最大细菌素活性。因此，培养26小时的LP21-2上清液用于后续实验。一般认为细菌素是次生代谢产物，其产生始于对数生长期的中后期，在稳定期达到最大，此时菌株的生长率逐渐降低。本研究认为LP21-2产生的细菌素是次生代谢产物。
4.细菌素的纯化
图4植物乳杆菌细菌素LP21–2的纯化。A:SephadexG-10柱；B:琼脂糖凝胶快速流动阳离子交换柱；C:辛基琼脂糖快速流动柱；D:Superdex-/GL柱和C18柱
纯化的植物乳杆菌细菌素LP21-2的色谱图如图4所示。用葡聚糖凝胶G-10柱纯化后，收集8-45毫升低盐馏分(图4A)。低盐级分通过阳离子交换柱洗脱，获得4个峰(图4B)，峰S3具有最高的抗微生物活性。用辛基-琼脂糖凝胶柱生成的图显示在图2C中，具有最高活性的O2峰被进一步纯化。O2峰用Superdex-/GL柱进一步纯化。图4D是凝胶柱的色谱图，只有峰P3具有抗菌活性。最后，使用C18柱进行进一步分析和纯化。在4.分钟的峰值具有抗菌活性(图4E)，并且金黄色葡萄球菌的抗菌图显示在峰值旁边。植物乳杆菌细菌素LP21-2可以吸附在阳离子柱上，说明在低pH下是阳离子肽，也可以吸附在辛基柱上，说明是疏水的，类似于乳素XN8-A。经过多步纯化后，细菌素的产量很低，这也是其他细菌素纯化策略所面临的问题，包括植物菌素ZJ5和细菌素-UVs。这个问题可以通过优化纯化工艺、改善培养条件和利用基因工程菌提高细菌素产量来解决。
5.植物乳杆菌细菌素LP21-2的分子量和氨基酸序列
图5植物乳杆菌细菌素LP21-2的液相色谱-串联质谱分析及其氨基酸序列与其他抗菌肽的比对
通过液相色谱-质谱/质谱系统分析，植物乳杆菌细菌素LP21-2的分子量为.84Da(图5A)。根据肽质谱中序列离子的通用命名法，我们推导出植物乳杆菌细菌素LP21–2由11个氨基酸组成，经LC-MS/MS预测其氨基酸序列为RPNEPRLLLPR(图5B)。
然而，植物乳杆菌细菌素LP21-2不能通过Edman降解进行测序，这可能是因为植物乳杆菌细菌素LP21-2的N末端被阻断，因此在Edman降解过程中不能被分解。这一现象与其他细菌素一致，具体原因需要以后进一步研究。
6.植物乳杆菌细菌素LP21-2的最低抑菌浓度和抗菌谱
表1植物乳杆菌细菌素LP21–2的抗菌谱
用C18柱对金黄色葡萄球菌ATCC纯化的植物乳杆菌细菌素LP21-2的最低抑菌浓度为0.18mg/mL。植物乳杆菌细菌素LP21–2对污染食品的常见细菌具有广泛的抗菌活性。植物乳杆菌细菌素LP21-2强烈抑制金黄色葡萄球菌ATCC、单核细胞增生李斯特菌ATCC、枯草芽孢杆菌CMCC、解淀粉芽孢杆菌CICC26、铜绿假单胞菌ATCC、荧光假单胞菌ATCC、福氏CICC氏菌ATCC和大肠杆菌ATCC，但对蜡状芽孢杆菌CMCC和伤寒沙门氏菌CMCC具有弱的抗菌活性LP21-2对酿酒酵母ATCC和小卷蛾CICC也有抑菌活性，但对圆卷叶螟CICC和黑曲霉CICC无明显抑制作用。
7.LP21–2对酶、热和酸碱度的敏感性
经胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后，植物乳杆菌细菌素LP21-2完全失活。然而，它不受蛋白酶K的影响。此外，植物乳杆菌细菌素LP21-2表现出良好的耐热性，尽管在不同温度和时间处理之间没有观察到显著差异。即使在℃处理15分钟，其活性仍保持在95.8%。另一方面，植物乳杆菌细菌素LP21-2在ph2-5范围内有明显的抗菌活性，但在ph6-9范围内无抗菌活性。
8.生长曲线和灭菌动力学曲线
图6A:用细菌素处理金黄色葡萄球菌后的生长曲线；
B:LP21–2对金黄色葡萄球菌的时间杀伤动力学
图6A显示金黄色葡萄球菌在20小时内的生长曲线。对于对照，金黄色葡萄球菌具有典型的生长曲线，具有滞后期、指数期和稳定期。以1倍和2倍的最低抑菌浓度添加植物乳杆菌细菌素LP21-2，培养物的OD值保持稳定。图6B显示了超过3小时的灭菌动力学曲线。对于对照，金黄色葡萄球菌的活菌数从9.14慢慢增加到9.72LogCFU/mL。加入细菌素后，金黄色葡萄球菌的活菌数从1.5h开始急剧下降，用1×MIC和2×MIC的细菌素处理3h后，活菌数分别为6.25和0LogCFU/mL。与植物乳杆菌细菌素LP21-2共培养10小时后，OD值略有升高，这可能与细胞质渗漏引起的浊度增加有关。灭菌动力学表明，活菌数随着时间和剂量的增加而减少。这一发现表明植物乳杆菌细菌素LP21-2的作用方式是杀菌。
9.植物乳杆菌细菌素LP21-2的抗菌机理
图7金黄色葡萄球菌细胞的扫描电镜和透射电镜图像
用扫描电镜观察细胞的形态结构。金黄色葡萄球菌细胞饱满，膜表面完整，如图7A所示。经1×MIC的细菌素处理2h后，细胞形态发生明显变化，膜表面出现皱纹和两极。这一发现表明植物乳杆菌细菌素LP21-2对细胞壁有影响。同时，也观察到细胞粘附现象，如细胞壁完整性消失所指示的。透射电镜观察金黄色葡萄球菌细胞的超微结构。在加入植物乳杆菌细菌素LP21-2之前，细胞显示出均匀的细胞质，膜与细胞壁紧密接触，具有良好的完整性(图7C)。暴露于植物乳杆菌细菌素LP21-22h后，细胞的细胞质减少，出现一个空腔，表明细胞内成分漏出(图7D)。这些结果表明，植物乳杆菌细菌素LP21-2通过作用于细胞壁形成孔来抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而破坏细胞膜的整个结构，最终泄漏出细胞内成分。基于这些结果，植物乳杆菌细菌素LP21-2的抗菌机制类似于第二类细菌素。
●结论
从牦牛酸奶中分离出的植物乳杆菌SHY21-2产生了植物乳杆菌细菌素LP21-2。植物乳杆菌细菌素LP21-2是一种新型细菌素，分子量为.84Da，氨基酸序列为RPNEPRLLLPR。植物乳杆菌细菌素LP21-2对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和酵母菌具有广谱抗菌性。植物乳杆菌细菌素LP21-2耐热耐酸，但可被蛋白酶灭活。此外，植物乳杆菌细菌素LP21-2作用于细胞膜，形成孔隙杀灭细菌。这些发现表明，植物乳杆菌细菌素LP21-2具有应用于食品保鲜的潜力；然而，现有的研究仍然不足。未来需要进一步分析杀菌细菌的分子机制，通过基因工程技术或共培养方法增加细菌素的产量，促进细菌素在工业生产中的应用。
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本文编辑：佚名
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